酒精性肝病（ALD）存在临床治疗药物有限、长期用药安全性不足的现实困境，氧化应激介导的肝细胞脂肪变性与细胞衰老会加速疾病进展。近日，浙江中医药大学袁小凤、窦晓兵团队在《Journal of Pharmaceutical Analysis》（中科院 1 区 TOP，IF=11.2）发表研究，系统阐明中药来源单体白术内酯 III（ATIII）直接靶向 AMPK，通过 p62 依赖的 Keap1 自噬降解激活 Nrf2 信号通路，改善酒精诱导的肝脏脂肪变性、炎症、氧化应激及肝细胞衰老，为酒精性肝病的天然药物研发与靶点挖掘提供坚实的生信与实验证据。

酒精性肝病全球发病率居高不下，现有抗炎、抗氧化治疗药物存在副作用明显，不适合长期给药的短板；氧化应激驱动的肝细胞衰老进一步推动病程进展，而白术内酯 III 在酒精性肝病中的药理作用与分子靶点尚不明确，亟待开发安全有效的干预策略。本研究采用 LieberDeCarli 乙醇饮食构建 ALD 小鼠模型，同时建立乙醇刺激 AML12 肝细胞损伤模型，整合转录组学、分子对接、细胞热位移分析（CETSA）、表面等离子体共振（SPR）、基因敲除 / 敲低、药理抑制剂干预等多种技术手段，完整解析白术内酯 III 靶向AMPK/Nrf2/Keap1信号轴的作用机制。

体内动物实验证实，ATIII（10、20 mg/kg）腹腔给药 8 周可显著改善 ALD 模型小鼠肝脏表型，调节小鼠体重、肝重及肝指数；下调血清总胆固醇、甘油三酯、转氨酶、总胆红素、碱性磷酸酶、低密度脂蛋白，上调高密度脂蛋白，实现肝功能与脂质代谢水平的改善。肝脏组织病理学检测表明，ATIII 能够缓解肝组织脂肪变性，抑制肝细胞凋亡；下调脂合成关键蛋白 SREBP1c、FAS、SCD1 表达，上调脂分解相关蛋白 CPT1α、ACOX1、PPARγ，纠正肝脏脂代谢紊乱。

药效表型层面，ATIII 能够显著下调肝脏促炎因子 TNFα、IL1β、IL6，抑制 NFκB 通路活化；提升抗氧化系统 SOD、GSH 水平，降低 MDA 含量；同时上调自噬标志蛋白 LC3、Atg5、Atg7、Beclin1 与 Nrf2 下游抗氧化蛋白 HO1、NQO1、Gclc、Gclm，协同发挥抗炎抗氧化效应。针对酒精损伤伴随的肝细胞衰老，ATIII 可减少 SAβgal 衰老阳性细胞，下调衰老标志物 p16、p21、Hmga1、γH2AX、H3K9me3，上调端粒相关蛋白 TERT、TRF2，显著抑制肝细胞衰老表型；同时促进 AMPKα T172 位点与下游 ACC 蛋白磷酸化，激活 AMPK 信号。

体外细胞实验进一步复现体内结果：乙醇诱导 AML12 细胞损伤模型中，ATIII 可降低细胞 ROS、MDA，提升 SOD、GSH，维持线粒体膜电位；促进 Nrf2 细胞核转位，上调下游抗氧化蛋白表达；抑制细胞衰老标志物 p16、p21、p53；调控 AMPK 亚基磷酸化修饰，提升激活型磷酸化水平，降低抑制位点磷酸化水平。

靶点确证实验证实 ATIII 可直接结合 AMPK 蛋白。分子对接结果显示 ATIII 与 AMPKα1β1γ1、AMPKα2β1γ1 复合物结合能分别为5.7945 kcal/mol、5.6509 kcal/mol；CETSA 实验证明 ATIII 可提升 AMPKα 蛋白热稳定性；SPR 检测得到结合解离常数 KD=15.7 μM。ATIII 不改变胞内 AMP、ADP、ATP 水平及 AMP/ATP 比值，也不依赖上游 LKB1、CaMKK2、GSK3β 激酶，区别于传统 AMPK 激动剂。

通路依赖性验证采用药理激动剂 / 抑制剂、基因敲低、全基因敲除多层次策略。AMPK 特异性激动剂 AICAR 能够增强 ATIII 对脂质蓄积、细胞衰老的抑制效果，AMPK 抑制剂 Compound C 则可逆转 ATIII 的保护作用。siRNA 介导 Nrf2 敲低后，ATIII 清除 ROS、拮抗细胞衰老的药效显著减弱。机制层面明确 ATIII 促进p62 介导的 Keap1 自噬降解：ATIII 处理下调 Keap1 蛋白，上调 p62、自噬相关分子；蛋白酶体抑制剂 MG132 无法阻断 Keap1 下调，而自噬抑制剂 3MA、CQ、p62 抑制剂 XRK3F2 可阻断 Keap1 降解；抑制 p62 会增强 Nrf2Keap1 蛋白相互作用，加速 Nrf2 蛋白降解，消除 ATIII 抗衰老效应。

更为关键的是，Nrf2 全基因敲除（Nrf2/）小鼠模型证明：当 Nrf2 缺失时，ATIII 改善肝损伤、脂质蓄积，下调 p16、p21、p53、γH2AX 等衰老标志物的保护效应完全消失，直接证明 ATIII 的肝脏保护效应完全依赖 Nrf2 通路。

该研究完整阐明白术内酯 III 作用链条：ATIII 直接结合并激活 AMPK，促进 p62 介导 Keap1 发生自噬降解，解除 Keap1 对 Nrf2 的抑制，促使 Nrf2 入核启动抗氧化基因转录，最终缓解酒精诱导的肝脏脂质蓄积、炎症、氧化应激与肝细胞衰老。本研究把自噬调控与 Nrf2 抗氧化通路形成完整调控闭环，为 ALD 靶点挖掘、中药天然活性成分的转化研究提供了严谨、完整的体内外实验体系与新思路。后续将围绕化合物成药性优化、体内药代动力学开展进一步研究，助力靶向酒精性肝病的中药单体药物开发。